Державна дослідна станція птахівництва

Білецька Г.В., Кулібаба Р.О., Юрко П.П., Ракова Г.А.

Інституту тваринництва НААН

Резюме. Наведено результати визначення причин падежу гусенят 4-6-тижневого віку з патологоанатомічними ознаками, характерними для хвороби Держі, в одному з приватних господарств України. Молекулярно-генетичними дослідженнями (детекція геному вірусу) ідентифіковано поліомавірус, що свідчить про появу нового захворювання гусей в Україні.

Ключові слова: хвороба Держі, вірусний ентерит гусей, парвовірус, поліомавірус, полімеразна ланцюгова реакція, дуплексна ПЛР.

Summery. The results of determination of causes mortality among goslings 4-6-weeks of age with pathology of Dergy’s disease in a private farms in Ukraine is represented. Molecular genetic studies (detection of the virus genome) identified poliomavirus, indicating the emergence of new diseases of geese in Ukraine.

Key words: Derzsy’s disease, goose enteritis, parvovirus, polyomavirus, polymerase chain reaction, duplex PCR.

Останніх років в Україні спостерігається загибель гусенят 4-10-тижневого віку з патологоанатомічними ознаками, характерними для хвороби Держі (вірусного ентериту гусей), яка спричиняється парвовірусом (goose parvovirus - GVP) родини Parvoviridae, роду Dependovirus. Якщо враховувати, що для цього захворювання існує вікова стійкість, яка настає у гусенят у 25-добовому віці, то прояв захворювання у птиці більш старшого віку можна вважати не типовим. Останнім часом стало відомо, що подібна патологоанатомічна картина спостерігається і при іншому захворюванні – геморагічному нефриті-ентериті гусей (haemorrhafic nephrities enteritis of geese - HNEG), який визивається поліомавірусом (goose haemorrhafic poliomavirus - GHPV), що відноситься до родини Polyomaviridae, роду Avipolyomavirus. Хвороба має і іншу назву - поліомавірусна геморагічна інфекція гусей [1].

Хвороба вперше описана у Венгрії у 1969 р., проте лише через 30 років було встановлено її етіологічний агент. Багато років хворобу асоціювали з випадками пізнього захворювання гусенят парвовірусним ентеритом (хворобою Держі) [1,2]. Останніх 10-12 років хворобу реєстрували у Франції. [3], Німеччині [4], Венгрії [5]. Загибель гусенят від цієї хвороби може досягати 70%.

При появі захворювання у гусенят спостерігаються риніт, кон’юнктивіт, нервові явища, діарея. Патологоанатомічні зміни подібні парвовірусній інфекції, а саме: геморагічний ентерит кишківника, запалення нирок, збільшення печінки та селезінки, асцит, набряки підшкірної сполучної тканини. Дисфункція нирок викликає підвищення концентрації мочевої кислоти в крові, в результаті чого у гусенят, які загинули внаслідок хронічного перебігу, знаходять вісцеральну подагру та урати в суглобах. У багатьох тканинах у інфікованих гусенят спостерігаються геморагії [1].

Труднощі диференційної діагностики полягають в неможливості точної ідентификації вірусу (парвовірус/поліомавірус) за допомогою стандартних методів, так як віруси мають близкі розміри (20 нм та 40-50 нм), обидва визивають загибель гусенят та гусячих ембріонів із подібними патологоанатомічними змінами, мають подібну цитопатичну дію в культурі фібробластів ембріонів гусей. Лише застосування молекулярно-генетичних методів діагностики дозволило визначити етіологічний агент хвороби.

В лабораторії профілактики захворювань птиці і молекулярної діагностики Інституту тваринництва розроблено та випробувано метод дуплексної полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який може використовуватись для одночасного визначення в «одній пробірці» двох типів збудників – парвовірусного та поліомавірусного ентеритів гусей [6].

Мета роботи - встановити причини захворювання гусенят, отриманих від гусей, щеплених проти парвовірусного ентериту (хвороби Держі), вирощуваних в одному з господарств Полтавської області.

Матеріали і методи. У приватному господарстві захворіли гусенята віком від 4 до 6 тижнів (кількох виводів). Рівень смертності молодняку, за свідченням власника, протягом тижня сягав 35%. У лабораторію профілактики захворювань птиці і молекулярної діагностики Інституту тваринництва були надані зразки крові хворих гусенят та тушки загиблої птиці.

Титр антитіл до парвовірусного ентериту гусей (хвороби Держі) визначали мікрометодом реакції нейтралізації з постійною дозою вірусу [7]. Бактеріологічні дослідження патматеріалу проводили згідно з настановами щодо діагностики колібактеріозу, пастерельозу, паратифу.

Для проведения молекулярно-діагностичних досліджень використовували тканини кишківника, печінки і шлунку гусенят. ДНК з біологічного матеріалу виділяли за допомогою набору реагентів «прискорена пробопідготовка» (Амплисенс, Россия) згідно з доданою інструкцією. ПЛР проводили за допомогою реагентів DreamTaq Green PCR MasterMix (2x) (ThermoScientific) з використанням термоциклера «Терцик» («ДНК-технология», Россия) за методикою дуплексної ПЛР, розробленою в лабораторії профілактики захворювань птиці і молекулярної діагностики Інституту тваринництва.

Електрофорез продуктів ампліфікації проводили з використанням 1,5 % агарозного гелю протягом 45 хв. при 120 V. Проби фарбували з використанням етидію броміду в ультрафіолетовому спектрі. Розмір ампліфікованих фрагментів визначали з використанням маркера молекулярних мас М-100. Присутність у пробах геному парвовірусу реєстрували за наявністю фрагментів ДНК розміром 539 п.н., поліомавірусу - 144 п.н.

Результати досліджень. При розтині загиблих гусенят виявили риніт, збільшення та переродження печінки, (рис.1), збільшення серця, катаральний ентерит тонкого та товстого кишківника, крововиливи на слизовій оболонці прямої кишки у вигляді «ялинки» (рис.2), кутикуліт (рис. 3), біло-сірий тягучий слиз у залозистому шлунку; збільшення нирок зі строкатим рисунком (рис.4), ниркову подагру, крововиливи на cерці та печінці, тобто ознаки, більшість яких характерна для хвороби Держі.

Рис. 1. Збільшена печінка у інфікованих гусенят	Рис. 2. Крововиливи на слизовій оболонці прямої кишки у вигляді «ялинки»
Рис. 1. Збільшена печінка у інфікованих гусенят	Рис. 2. Крововиливи на слизовій оболонці прямої кишки у вигляді «ялинки»

У крові хворих гусенят були виявлені антитіла до парвовірусного ентериту гусей (хвороби Держі) в титрах 1:4-1:8. Якщо враховувати вік гусенят, то рівень антитіл, який виявили при дослідженнях, свідчить про наявність материнського імунітету щодо парвовірусного ентериту. Патогенних збудників бактеріальних захворювань не виявили. Отже, результати серологічного аналізу сироватки крові на хворобу Держі та бактеріологічного дослідження патматеріалу не вказують на парвовірусний ентерит гусей або бактеріальні інфекції (колібактеріоз. пастерельоз, паратиф), які необхідно диференціювати при встановленні діагнозу на вірусний ентерит.

За результатами молекулярно-генетичних досліджень із використанням відповідних контрольних зразків на парво- та поліомавірус встановлено, що ампліфіковані фрагменти ДНК, виділені з органів загиблих гусенят після проведення ПЦР, мають розмір 144 п.н, а не 539 п.н., що вказує на присутність у пробах геному поліомавірусу, а не парвовірусу, як припускали.

Висновки:

1. Причиною загибелі гусенят є поліомавірусна геморагічна інфекція гусей.
2. Діагноз захворювання встановлено на підставі молекулярно-генетичних досліджень із використанням методу дуплексної ПЛР для визначення геномів парво- та поліомавірусів у клінічному матеріалі, який розроблено в лабораторії профілактики захворювань птиці і молекулярної діагностики ІТ НААН.
3. Проведені дослідження свідчать про появу нового небезпечного захворювання гусей в Україні.

Список літератури

1. Guerin J. L. A novel polyomavirus goose hemorrhagic polyomavirus is the agent of hemorrhagic nephritis enteritis of geese./ J. L. Guerin, J. Gelfi, L. Dubois and all. - J. Virol. Vol.74, No. 10 – 2000 – P. 4523–4529.
2. Bernath, S. Investigations for clearing the etiology of the disease appeared among goslings in 1969. I. Animal infection experiments (in Hungarian, with English abstract)/ Bernath, S. & Szalai// Magyar A?llatorvosok Lapja , 1970.-25.-P. 531-/536
3. Guerin, J.L., Pingret, J.L., Gelfi, J., Dubois, L., Sans, P., Vuillaume, A., Boucraut-Baralon, C. & Bertagnoli, S. (1999). Isolation of avian polyomavirus, associated with hemorrhagic nephritis and enteritis of geese. Proceedings of the 1st World Waterfowl Conference,1999.-P.66-271). Tachung, Taiwan.
4. Miksch, K.,Detectionof goose haemorrhagic polyomavirus (GHPV) in flocks with haemorrhagic enteritis and nephritis of geese in southern Germany (inGerman)/ Miksch, K., Grossmann, E., Kohler, K. & Johne, R. //Berliner und Mu? nchener tierarztliche Wochenschrift,2002.-115.-P.390-394.
5. Palya V. Epizootic occurrence of haemorrhagic nephritis enteritis infections of geese./ V. Palya, E. Ivanics, R. Glavits et al.// Avian Pathol, 2004.-33(2).- Р. 244–250.
6. Кулибаба Р.А. Молекулярная диагностика энтеритов гусей разной вирусной этиологии / Кулибаба Р.А., Юрко П.С., Белецькая А.В.// (в печати)
7. Білецька Г.В. Мікрометод реакції нейтралізації для визначення антитіл проти вірусного ентериту гусей. /Білецька Г.В.Юрко П.С., Музика Н.М., Грибкова Н.П.// Вет. мед.: міжвід. тем. наук. зб. ННЦ «ІЕКВМ». - Харків, 2012. - Вип. 96.- С. 145-146.