Державна дослідна станція птахівництва

УДК 619:616-07:576.85

О. В. Циновий, кандидат біологічних наук

О. А. Шомін

С. В. Рябінін

Є.М. Білецький, кандидат біологічних наук

Державна дослідна станція птахівництва НААН України

Резюме. Розроблено тест-систему ІФА для визначення специфічних антитіл до метапневмовірусу в сироватках крові курей. Вивчено ефективність її використання для експрес-діагностики даної інфекції, контролю поствакцинального імунітету у щепленої птиці. Визначено технологічні характеристики даного діагностикуму та наведена його порівняльна характеристика з закордонним аналогом.

Ключові слова: Імуноферментний аналіз, метапневмовірус, кури.

Вступ. Використання високопродуктивних кросів птиці, що імпортуються в Україну, призвело до розповсюдження на птахофабриках метапневмовірусної (пневмовірусна) інфекція птиці (MПВІ), яка вражає верхні дихальні шляхи індиків та курей: у індиків – рінотрахеїт (TurkeyRhinoTracheitis – TRT) – запалення носових пазур, синусів та трахеї; у курей та курчат-бройлерів – «Синдром пухлої голови» (SHS – Swollenheadsyndrome). Причиною захворювання є пневмовірус.

Захворюваність і смертність при TRT-інфекції серед птиці батьківських та промислових стад на фермах коливається від 4 до 90 %. при SHS в бройлерних стадах може бути від 1 до 10 % [ 1, 2].

Вірус передається прямим контактним та повітряно-кра­пельним шляхами. На сьогоднішній день МПВ-інфекція зустрічається у всіх країнах світу з розвинутим птахівництвом (Ізраїль, США, Канада, Англія, Північна Ірландія, Бразилія, Марокко, Росія)[ 5 ].

Дослідження щодо розповсюдження МПВ-інфекції в Україні не проводились. Напруженість імунітету у щепленої птиці до метапневмовірусу спеціалістами господарств не контролювалася.

В багатьох країнах світу для діагностики МПВ-інфекції використовують різні реакції: РНІФ, РН, ІФА та метод імуноцитохімії. За допомогою їх можна встановити епізоотологічний діагноз на МПВ-інфекцію, але оцінити напруженість імунітету після щеплення птиці неможливо. Тому необхідні інші більш доступні і чутливі серологічні реакції, які можуть бути використані як для вивчення епізоотичної ситуації в господарствах щодо МПВ інфекції, так і контролю імунітету після щеплення птиці[2-5 ] .

Зараз на озброєнні науково-дослідних та виробничих ветеринарних лабораторій в Україні, відсутні стандартні вітчизняні діагностичні набори для експрес – діагностикиMПВI птиці, а закордонні аналоги мають дуже високу ціну (не менше 25 тисяч гривень) і не доступні для широко колу ветеринарних лабораторій.

За період 2012-2014 році в Інституті птахівництва НААН (нині Дослідна державна станція птахівництва) розроблено вітчизняну ІФА- тест-систему для діагностики метапневмовірусної інфекції птиці у птахівничих господарствах різних форм власності.

Мета роботи. Розробити тест-систему ІФА для визначення специфічних антитіл до метапневмовірусу в сироватках крові курей.

Матеріали та методи. Діагностичну цінність ІФА тест-системи встановлювали у порівнянні з ІФА-тест-системою ( «IDEXX» (США).

Накопичення метапневмовірусу для ІФА-методу здійснювали шляхом його репродукції на перещеплюваній культурі клітин Vero або на первинно-трипсинізованій культурі клітин курячих СПФ-ембріонів (ФЕК).

Для ІФА-діагностикуму напрацьований антиген очищали та концентрували за розробленою нами схемою, яка включала підготовчий етап, попереднє очищення вірусу,концентрування вірусу та завершальне очищення вірусу.

Гіперімунну сироватку крові отримували шляхом гіперімунізації 30-денних курчат за розробленою нами схемою (отримано патент). Нормальну сироватку одержували з крові інтактних курчат віком 90 діб методом тотального знекровлення. Діагностичні сироватки крові зберігали у замороженому (за температури мінус 20 о С) або ліофілізованому стані. Сенсибілізація планшетів, внесення досліджуваних сироваток на планшети та антивидового кон'югату проводили за загальноприйнятими методами .

Результати досліджень. Для підбору оптимального робочого розведення сироватки та виведення формули з метою визначення титрів антитіл в одному розведенні, досліджено 100 проб польових сироваток крові курей з різним рівнем антитіл до метапневмовірусу. Рівень антитіл визначали методом непрямого ІФА послідовними розведеннями сироватки від 1:100 до 1:12800.

Для виготовлення ІФА-діагностикуму відпрацьовані оптимальні співвідношення компонентів (антигену та кон'югату) та визначено їх робочі розведення методом «шахового титрування»:

• антигену, що наносили на планшет –1:500
• антивидового імунопероксидазного кон'югату проти Іg G курей –1:4000.

Для визначення оптимального розведення сироваток та виведення формулиобрахунків титрів антитілметодом одного розведення проводили математичний аналіз отриманих результатів. Вираховували значення S/P (відношення оптичної щільності досліджуваної сироватки до оптичної щільності позитивного контролю, з відніманням оптичного показника негативного контролю): S/P100, S/P200, S/P400, S/P800 – в розведеннях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800 (результати оброблялися з використанням комп'ютерної програми MicrosoftExсel) .

Для кожного розведення визначали коефіцієнт кореляції з значенням титрів, отриманих методом послідовних розведень ( значення lgT до lgS/P). Коефіцієнт кореляції складав для розведень: 1:100-90,59 % ; 1:200 – 92,00 %; 1:400 – 92,16 % ; 1: 800 – 88,90 %

Розведення сироватки 1:400 мало найвищий коефіцієнт кореляції, і було взято за робоче.

У відповідності з значеннями оптичних густин досліджуваних сироваток, за допомогою комп'ютерної програми MicrosoftExсel, була побудована калібрувальна крива й виведено рівняння лінійної регресії для обрахунку логарифмічного значення титрів антитіл у сироватках (рис .1)

Рис. 1 - Калібрувальна крива значення lgTдоlgS/P

Обраховано формулу титрів антитіл у сироватках крові курчат при тестуванні їх в одному розведенні: LgT = 3,7981 + 0,8524 · lg (S/P400), що спрощує проведення аналізу.

Для об'єктивної оцінки імунної відповіді встановлено позитивно-негативний поріг (ПНП). Досліджено 40 негативних сироваток крові від курчат, отриманих при вирощуванні у камеральних умовах. Сироватки протестовані розробленим нами набором ІФА для визначення антитіл методом послідовних розведень. В якості позитивного та негативного контролю були взяті контрольні сироватки (позитивний та негативний контроль), які були отримані на інтактних курчатах. Проведено перерахунок для тестування в одному розведенні та вирахувано ПНП. На основі отриманих результатів, за раніше виведеною формулою lgT=3,7981+0,8524·lg (S/P), визначено ПНП - негативні сироватки від 0 до 850, позитивні – від 850 та вище.

Оцінку чутливості та специфічності тест-системи проводили шляхом порівняльного аналізу результатів тестування сироваток у тест-системі ІФА, що розроблена в ДДСП НААН з ІФА-тест-системою фірми «IDEXX» (США). Паралельно порівнювалися 60 сироваток крові курчат з різною активністю (30 сироваток від курей, що не щеплювалися проти метапневмовірусної інфекції (МПВІ) та 30 сироваток крові курчат, щеплених проти МПВІ).

У не щепленої птиці титри антитіл в ІФА МПВ (ДДСП) склали від 24 до 79 (при ПНП 850), в ІФА МПВ («IDEXX») - від 37 до 390 (при ПНП 396). У щепленої птиці - від 3017 до 9756 (в ІФА МПВ, ДДСП), та від 674 до 2578 (ІФА МПВ, «IDEXX»). У зв'язку з тим, що набори мають різний позитивно-негативний поріг, титри антитіл відрізняються по абсолютним значенням.

Таким чином, простежується 100 % подібність результатів по даним діагностикумам, тобто сироватки курей, що не мають антитіл до даного захворювання не фіксуються в обох наборах і навпаки, сироватки з наявністю протективних титрів антитіл до цього захворювання фіксуються двома використаними тест-системами.

Висновок. Завдяки розробленій тест-системі ІФА для визначення специфічних антитіл до метапневмовірусу можна проводити епізоотологічний моніторинг даного захворювання та контроль поствакцинального імунітету у щепленої птиці. Реакція є кількісною, простою у використанні, проводиться в одному розведенні сироватки. У порівнянні з закордонними аналогами вітчизняна тест-система дешевша у 8 разів.

Бібліографічний список.

1. Борисова И.А. Пневмовирусная инфекция птиц / И.А. Борисова, С.К. Старов //Труды Федерального центра охраны здоровья животных. – Владимир, 2006. – Т.4. – С. 281-296.
2. Волкова М.А. Непрямой вариант иммуноферментного метода для определения антител к пневмовирусу птиц / М.А. Волкова, Г.В. Батченко, Н.С. Мудрак // Актуальн. пробл. инфекц. патологии жив-х: матер. Междунар. науч. конф., посвящен. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 358-361.
3. Ирза В.Н. Серологический мониторинг по птичьему пневмовирусу (AvianPneumovirus - APV) в России / В.Н. Ирза, Т.В. Оковытая, В.В. Борисов // Конференция по птицеводству. - Зеленоград, 2003. – С. 222-223
4. Методические рекомендации по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы с использованием серологических реакций. Ч.1: методическиерекомендации/ФГУ «ВНИИЗЖ», 2008.– С. 59-60.
5. Chettle N. J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rinotracheestis / N. J. Chettle, P.J. Wyeth// Br. Vet. J. – 1988. – 144:282-287.

Referenses (translated & transliterated)

1. Borisova I.A. Pnevmovirusnaya infektsiya ptits / I.A. Borisova, S.K. Starov //Tr. Federalnogo tsentra okhrany zdorovya zhivotnykh. – Vladimir, 2006. – T.4. – S. 281-296
2. Volkova M.A. Nepryamoy variant immunofermentnogo metoda dlya opredeleniya antitel k pnevmovirusu ptits / M.A. Volkova, G.V. Batchenko, N.S. Mudrak // Aktualn. probl. infekts. patologii zhiv-kh: mater. Mezhdunar. nauch. konf., posvyashchen. 45-letiyu FGU «VNIIZZh». – Vladimir, 2003. – S. 358-361.
3. Irza V.N. Serologicheskiy monitoring po ptichyemu pnevmovirusu (Avian Pneumovirus - APV) v Rossii / V.N. Irza, T.V. Okovytaya, V.V. Borisov // Konferentsiya po ptitsevodstvu. –Zelenograd, 2003. – S. 222-223.
4. Metodicheskiye rekomendatsii po diagnostike zabolevaniy selskokhozyaystvennykh zhivotnykh i ptitsy s ispolzovaniyem serologicheskikh reaktsiy. Ch.1: metodicheskiye rekomendatsii /FGU «VNIIZZh», 2008. – S. 59-60.
5. Chettle N. J. The use of an ELISA test to detect antibodies to turkey rinotracheestis / N. J.Chettle, P.J. Wyeth// Br. Vet. J. – 1988. – 144:282-287.

DIAGNOSISMETAPNEUMOVIRUS INFECTION OF BIRDSUSING MODERN METHODS

Tsynovyi O. V., candidate of biological scinces

Shomin O. A.

Ryabinin S. V.

Sammary. A national system of ELISA test for determination of specific antibodies in the blood serum of metapneumovirus chickens. The efficiency of its use for the rapid diagnosis of infection, control of post-vaccination immunity in vaccinated birds. The technological characteristics of the diagnostic and given its comparative characteristics of the foreign counterpart.

Key words: ELISA, metapneumovirus, chichens.

Отримати консультацію з даної теми