Державна дослідна станція птахівництва

Національної академії аграрних наук України



Hosting Ukraine

О.М. Котик, В.Т. Чорнобай, Н.Ф. Комісаренко, В.А. Труфанова

Український НДІ птахівництва

Харківський НД хіміко-фармацевтичний інститут

Гриби Fusarium sporotrichiella, розвиваючись на кормових і харчових субстратах, здатні виробляти отруйні речовини, які можуть спричинити тяжкі захворювання сільськогосподарських тварин і людини - фузаріотоксикози [1]. Щодо структури фузаріотоксинів, які мають дермонекротичну активність і виявляються шкірною пробою на кролику, існує дві точки зору. Згідно з першою з них, мікотоксини F. sporotrichiella відносяться до стероїдних речовин буфадієнолідної природи [2] і за будовою вони близькі до серцевих отрут морської цибулі [3]. За даними інших дослідників, ці речовини відносяться до тетрациклічних сесквітерпенів [4].

Мета справжньої роботи – виділити один з мікотоксинів F. sporotrichiella та вивчити його фізико-хімічні властивості та токсичну активність.
Матеріали та методи

У роботі використовували чотири штами F. sporotrichiella: 1-23 - з проби пшениці врожаю 1972, завезеної з Сибіру [5]; 53-1 – із проби кукурудзи, відібраної в одному з птахівницьких господарств України в момент спалаху фузаріотоксикозу гусенят [6]; 5328а – з колекції лабораторії антибіотиків та мікології Всесоюзного інституту експериментальної ветеринарії (виділено О.С. Квашніною у 1954 році з нескошеного вівса, що викликав кормовий токсикоз великої рогатої худоби в господарстві Московської області); 2m - мутант, отриманий шляхом впливу на конідії штаму 5328а N-нітрозометилсечовини і характеризується обмеженим зростанням колоній [7]. Вивчені штами вирощували на стерильній суміші вівса і проса протягом 4-5 діб при +28 оС і потім 4 тижні при +8 оС. Вирощені культури штамів на зерні висушували та розмелювали.

Методика виділення мікотоксину полягала у наступному. Культури F. sporotrichiella екстрагували сумішшю ацетону та хлороформу 1:1. Екстракти упарювали у вакуумі до повного видалення розчинника, маслоподібний залишок темно-бурого кольору частково очищали від домішок шляхом змішування з 20-кратним об'ємом метанолу, нагрітого до 50-55 оС, і відділення фільтруванням осаду, що випав.

Зразки 3б-гідрокси-4в,15-діацетокси-8б-(3-метилбутирилокси)-12,13-епокси-Δ9-трихотецену (мікотоксину Т-2) і 3б,4в-дигідрокси-15-ацетокси-8б-(3- метилбутирилокси)-12,13-эпокси-Δ9-трихотецену (мікотоксину НТ-2) отримані від H.R. Burmeister (Nothern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, 61604).
Результати та їх обговорення

Встановлено, що вирощені на зерні культури штамів 53-1 і 5328а надавали при додаванні їх у кількості < 2% до раціонів 1-3-тижневих курчат і 1-3-тижневих гусенят сильна токсична дія, що виявляється в затримці зростання, збільшенні смертності та розвитку характерних некротичних уражень слизових оболонок ротової порожнини та язика. Екстракти штамів 1-23, 53-1, 5328а та 2m викликали дермонекротичну реакцію при нанесенні на шкіру кролика.

Тонкошарова хроматографія в системі етилацетат-толуол 3:1 в екстрактах штамів 1-23, 53-1, 5328а і 2m були виявлені три речовини з Rf 0,17, 0,30 і 0,58, флуоресцентні в УФ-променях обприскування пластин сірчаною кислотою і нагрівання до 110 оС протягом 10 хвилин, а також біоавтографічно за допомогою штамів Saccharomyces fragilis 10g (отриманий від В.І. Дахновського, Інститут мікробіології та вірусології АН УРСР) і Candida pseudotropicalis 44 . Рухляди, Український інститут експериментальної ветеринарії). Виявилося, що речовини з Rf 0,17 і 0,58, а також за результатами біоавтографії ідентичні відповідно до мікотоксинів НТ-2 і Т-2, які використовуються як контроль.

З метою виділення окремих мікотоксинів екстракти штаму 2m (штам відрізняється підвищеною здатністю до токсиноутворення) наносили на колонку силікагелю ЛЗ 5/40 мкм, що містить 13% гіпсу. Співвідношення сорбенту до екстракту, що роздягався, становило 10:1. Колонку послідовно промивали петролейним ефіром; сумішами петролейного ефіру з бензолом у співвідношеннях 4:1, 1:1 та 1:4; бензол; сумішами бензолу з хлороформом у співвідношеннях 4:1, 1:1 та 1:4; сумішшю хлороформу з ацетоном 1:1; ацетоном. Контроль за розподілом речовин здійснювали шляхом тонкошарової хроматографії. Фракції, що містять речовину, що не відрізняється хроматографічно від мікотоксину Т-2, об'єднували, упарювали і кристалізували з діетилового ефіру додаванням 10-12% гексану.

В результаті було виділено індивідуальну кристалічну речовину з точкою плавлення 150-152 оС; (б) D21+12 оС (з 1,0 в етанолі), -50 про циклогексане, -35 про суміші циклогексану з хлороформом (4:1); С24 Н34 Про 9.

В ІЧ-області спектру виявляються смуги поглинання, характерні для ОН-групи (3500, 1040, 1020 см-1), = СОС – групи (3040 см-1), складноефірні зв'язки (1725, 1250 см-1), (СН3) 2-СН - групи (1170, 1145 см -1) та ін.

Для визначення природи кислот, що утворюють складноефірні зв'язки, були отримані гідроксамати. Методом хроматографії на папері [8] визначено гідроксати оцтової та ізовалеріанової кислот.

Вихідна речовина ацетилюється, що підтверджує присутність у молекулі вільної оксигрупи і не відновлюється боргідридом натрію (відсутність карбонільних груп). У з'єднанні визначено два ацетильні залишки [9]. При паралельному хроматографуванні отриманої нами речовини та мікотоксину Т-2 у системах: хлороформ-метанол (95:5), бензол-ацетон (3:2) та бензол-метанол-оцтова кислота (24:2:1) встановлено, що обидві речовини мають однакові величини >Rf (відповідно, 0,53, 0,58 та 0,28). Проба змішування не дала депресії температури плавлення; їхні ІЧ-спектри були також тотожні. Ці дані дозволили нам зробити висновок, що отримана нами речовина ідентична 3б,4в-дигидрокси-15-ацетокси-8б-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокси-∆9-трихотецену (мікотоксину Т-2) [4].

При вивченні токсико-біологічної активності виділеного нами мікотоксину встановлено, що мікотоксин має значну антибіотичну активність: у концентрації 0,25 мкг/мл він пригнічує ріст Saccharomyces fragilis 10g і в концентрації 0,40 мкг/мл - Candida pseudotropicalis 4. Lebistis reticulatus (гуппі), що використовуються як тест-об'єкт для виявлення в кормах мікотоксинів [10], виявилися дуже чутливими до мікотоксину (LD50 = 80 мкг/л). Включення мікотоксину в раціони 1-20-денних курчат (Gallus domesticus), індичат (Meleagris gallopavo), каченят (Anas boschas domestica) і гусенят (Anser domesticus) у кількості > 1 мкг/г корми викликало у пташенят стан токсикозу, що супроводжується , затримкою зростання, пригніченням, скуйовдженням оперення, розвитком характерних некротичних уражень слизових оболонок ротової порожнини та язика. Нанесення мікотоксину на шкіру кролика в кількості 0,025 мкг викликало гіперемію, дози > 0,05 мкг викликали набряк та некроз.

Оскільки штами F. sporotrichiella, що вивчаються в різних географічних зонах країни (Сибір, Україна, Московська область), здатні виробляти мікотоксини з групи 12,13-эпокси-Δ9-трихотеценів, то, ймовірно, ці мікотоксини є етіологічним фактором фузаріотоксикозів сільськогосподарських тварин, мали місце у нашій країні [11]. Отримані нами результати відповідають даним ряду авторів [12-15], які встановили раніше, що F. sporotrichiella виробляють мікотоксини з групи 12,13-эпокси-Δ9-трихотеценів.

Таким чином, у культурах штамів F. sporotrichiella методом тонкошарової хроматографії виявлено не менше трьох речовин із групи 12,13-епокси-Δ9-трихотеценів, у тому числі мікотоксини Т-2 та НТ-2. Адсорбційною колонковою хроматографією на силікагелі з 13% гіпсу з культури F. sporotrichiella виділено кристалічну речовину, яка за фізичними та хімічними властивостями ідентична 3б, 4в-дигідрокси -15-ацетокси - 8б -(3-метилбутирилокси) -12,13 -епокси -трихотецену (мікотоксину Т-2). Встановлено, що виділений мікотоксин має значну антибіотичну активність по відношенню до Sacch. fragilis 10g та C. pseudotropicalis 44 пк. у концентраціях 0,25-0,40 мкг/мл, а також токсичний для акваріумних риб Lebistis reticulatus (LD50=80 мкг/л) та 1-20-денного молодняку ​​сільськогосподарського птаха при згодовуванні раціонів, що містять >1 мкг/г мікотоксину. У кількостях > 0,025 мкг мікотоксин виявляється шкірною пробою на кролику.

Література:

Саркисов А.Х., Квашнина Е.С. Токсико-биологические свойства грибов Fusarium sporotrichioides.- В кн.: "Перезимовавшие под снегом зерновые культуры". М.-Изд. МСХ СССР, 1948.-С.86-92.
Олифсон Л.Е. Химические и биологические свойства ядовитых веществ зерна, пораженного грибами Fusarium sporotrichiella: Автореф. дис. … докт. биол. наук.- Оренбург, 1965.
Физер Л., Физер М. Стероиды.- М., «Мир», 1964.
Bamburg J.R.,Strong F.M. 12,13-Epoxytrichothecenes // In: Microbial Toxins (eds. S.Kadis, A.Ciegler, S.J.Ajl).-New York. Acad. Press.1971.-Vol.7.-P.207-292.
Котик А.Н. Токсико-биологическое исследование кормов для птицы. – В кн.: Итоги науч. исследований и рекомендации по профилактике болезней птиц в хозяйствах промышленного типа.- М.: Изд-во ВАСХНИЛ, 1973, с. 117.
Дорошко И.Н., Котик А.Н. Случай фузариотоксикоза гусят // Птицеводство.-1975.-N 11.-С.40-41.
Котик А.Н. Ауксотрофные и морфологические мутанты Fusarium sporo- trichioides полученные при воздействии N-нитрозометилмочевины // Генетика.-1969.-Т.5.-N 7.-С. 98-101.
Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса и К. Мацека.- М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1962.
Фридрих А. Определение ацетильной (бензольной) группы по Куну и Роту.- В кн.: Практика количественного органического микроанализа.- М.: 1939, с. 204-209.

Copyright © 2013 - 2022 Державна дослідна станція птахівництва
Національної академії аграрних наук України