Державна дослідна станція птахівництва

А.Н.Котик, В.А.Труфанова

Інститут птахівництва Української академії аграрних наук

Т-2 токсин та інші трихотеценові мікотоксини, що виробляються грибами з роду Fusarium, Mirothecium, Stachybotrys, Trichoderma та ін, дуже широко поширені як контамінанти кормових субстратів, характеризуються високою токсичністю і, отже, становлять істотну небезпеку для сільськогосподарських тварин. Найбільш важливим елементом профілактики мікотоксикозів тварин є організація систематичного контролю за вмістом мікотоксинів у кормах на всіх етапах їх виробництва, зберігання, транспортування та згодовування. Ефективний контроль можливий лише за наявності доступних високочутливих методів аналізу. В даний час для визначення вмісту Т-2 токсину в кормах використовують методи, засновані на хроматографії - тонкошарової (ТСХ) або газорідинної (ГЖХ) (Еллер К.І., Соболєв В.С., 1983; Scott P.M. et al., 1970 ;Ikediobi C.O. et al., 1971). Розроблено також методи імуно-ферментного аналізу (ІФА) (Pestka JJ et al., 1981; Peters H. et al., 1982). Біоавтографічний (БАГ) метод визначення трихотеценових мікотоксинів (Котик А.Н. та ін., 1979; Котик А.М., Труфанова В.А., 1989) характеризується високою чутливістю та відтворюваністю результатів, проте не знайшов широкого застосування у мікотоксикологічній практиці.

У цій статті наводиться порівняльний аналіз результатів багаторічного використання різних методів індикації Т-2 токсину у кормових субстратах.

Матеріали і методи. Аналіз комбікормів, зерна, грубих кормів, хлібопродуктів на вміст Т-2 токсину проводили за допомогою ТСХ-методу ВНІІВС (1980), ГЖХ-методу Інституту харчування РАМН (Тутельян В.А. та ін., 1984), за ГОСТ 28001-88 (М., 1989), ГЖХ-методу, розробленого нами (Абульханова В.Ш., Абульханов А.Г., Тремасов М.Я. та ін., 1990) та БАГ-метода (Котик А.М. та ін. , 1987). Вивчили ступінь вилучення Т-2 токсину із субстратів при внесенні його у кількостях 50, 100, 200 та 1000 мкг/кг, а також провели скринінг кормів на вміст Т-2 токсину, враховуючи при цьому специфічність та чутливість методів.

Результати та їх обговорення. Метод ВНІІВС, заснований на ТШХ, не дозволяє виявити Т-2 токсин у концентраціях менше 500-800 мкг/кг; тривалість аналізу становить 6-7 годин. Заміна проявника – сірчаної кислоти на параанісовий альдегід дещо підвищує чутливість методу – до 400-500 мкг/кг. Оскільки молекула Т-2 токсину не містить, як відомо, флуоресціюючих компонентів, то істотно підвищити чутливість ТСХ-методу за рахунок нових агентів, що виявляють проблематично. Все ж таки метод може бути використаний як скринінговий для якісного визначення в кормах Т-2 токсину при великому забрудненні - 1000 мкг/кг і вище.

Застосування ГЖХ-методу, запропонованого Інститутом харчування РАМН (1984) дозволяє визначити Т-2 токсин у зерні у кількості 50 мкг/кг; метод добре відтворюється. Істотний недолік - не завжди стабільні ТФА-похідні Т-2 токсину, що непросто подолати без висококваліфікованого хіміка-синтетика. До того ж, для здійснення методу потрібно більш повне очищення екстракту, особливо при аналізі грубих і соковитих кормів, а також комбікормів, що містять трав'яне борошно; втрати Т-2 токсину у цих об'єктах можуть становити 50-60%. Нами вдосконалено систему підготовки екстрактів, отриманих з комбікормів, грубих і соковитих кормів, шляхом очищення екстрактів на колонці з активованим вугіллям; втрати при цьому зведено до 15-30%, час аналізу збільшився незначно – на 15-20 хвилин.

Чутливість модифікованого нами методу для зернових становить 25 і для комбікормів та грубих кормів – 50 мкг/кг. Метод може бути використаний у процесі масових досліджень кормів, у тому числі імпортованих на вміст Т-2 токсину. Тривалість аналізу 5-5,5 години, за робочий день співробітник може провести 5-6 аналізів. Проте необхідність використання складного дорогого обладнання для газової хроматографії, наявності висококваліфікованих фахівців для його обслуговування суттєво обмежують можливість застосування даного методу – принаймні найближчим часом – у лабораторіях не лише районного, а й обласного та республіканського рівня.

Застосування нами протягом останніх 6-7 років біоавтографічного (БАГ) методу для якісного та кількісного визначення Т-2 токсину дозволяє охарактеризувати даний метод як дуже надійний, високочутливий, простий при виконанні та придатний для відтворення в лабораторії будь-якого рівня, де можна поставити термостат та настільний бокс - навіть у приміщенні прикордонного пункту. Пропонований метод очищення екстракту - за допомогою оцтовокислого свинцю та наступною переекстракцією в хлороформ - прийнятний як для зернових, так і для грубих та соковитих кормів; втрати токсину в екстракті не перевищують 25-30%. Чутливість методу становить близько 30 мкг/кг. Всього на вміст Т-2 токсину за допомогою БАГ-методу нами досліджено понад 1500 зразків кормів (зернові, комбікорми, трава, сіно, силос, тапіока та ін.), хліба та хлібопродуктів, що надійшли з 35 областей та республік Росії, України, Казахстану , Білорусь. При цьому в 12,5% проб виявлено Т-2 токсин, у 7% проб поряд з Т-2 токсином виявлено також НТ-2 токсин. Всі екстракти, в яких виявляли Т-2 токсин, були досліджені за допомогою ГРХ, ХМ/СМ та ЯМР-спектроскопії з метою ідентифікації мікотоксинів. Результати цих досліджень показали абсолютний збіг із даними біоавтографічного аналізу. Максимальна кількість Т-2 токсину - 4200 мкг/кг - виявлено у сіні одному з господарств Татарстану (Тремасов М.Я. та інших., 1995); у 32% проб вміст Т-2 токсину перевищував рівень ГДК (50 мкг/кг).

Істотно, що БАГ-метод придатний також для визначення трихотеценових мікотоксинів, що виробляються грибами Dendrodochium, Myrothecium, Stachybotrys (Котик А.М., 1982; Котик А.М., Труфанова В.А., 1989), а також нафтохінонового фузаруотіна (Котик О.М., Труфанова В.А., 1990).

На наш погляд, широкому впровадженню біоавтографічного методу визначення трихотеценових мікотоксинів у практику ветеринарних лабораторій перешкоджає відсутність у країні курсів з підготовки спеціалістів-мікотоксикологів.

Заключення

Порівняльний аналіз результатів багаторічного використання різних методів індикації Т-2 токсину в кормах - ТСХ, ГЖХ та БАГ - показав, що на сьогоднішній день при існуючому стані оснащеності лабораторій контроль за вмістом Т-2 токсину в кормах та с-х продуктах реально можливий лише за використанні біоавтографічного методу, який за чутливістю не поступається ГЖХ-методу, а за простотою та економічністю в десятки разів перевершує його.

Література:

1. Абульханова В.Ш., Абульханов А.Г., Тремасов М.Я., Сметов П.К., Гусманов К.Ф. Методические рекомендации по индикации Т-2 токсина в зернофураже с помощью газожидкостной хроматографии.- ГУВ .- М., 1990.- 9 с.
2. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма. Методы оп- ределения микотоксинов: Т-2 токсина, зеараленона и охратоксина А.- ГОСТ 28001-88.- М., Издательство стандартов, 1989.
3. Котик А.Н., Рухляда В.В., Труфанова В.А. - Способ обнаружения в кормах микотоксинов из группы 12,13-эпокси-дельта-9-трихотеценов //А.С.660653 СССР, М.Кл. А 23 К1/0011. N 2473360/30-15; Заявл. 04.04.77.- 1979.- бюлл. N 17.
4. Котик А.Н., Рухляда В.В., Труфанова В.А. Методические указания по количественному определению Т-2 токсина в зерне и комбикормах. Утверждены ГУВ Госагропрома СССР 26 мая 1987 г. В книге: "Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические", под ред. Б.И.Антонова.- М., ВО "Агропромиздат".-1991.- С.122-124.
5. Котик А.Н. Обнаружение стахиботриотоксинов // Ветеринария.- М., 1982.-N 5.-С.66-67.
6. Котик А.Н., Труфанова В.А. Биоавтографический метод определения трихотеценовых микотоксинов в зерне и продуктах его переработки // Гигиена и санитария.- М.: Медицина, 1989.- N 9.-C.53-54.
7. Котик А.Н., Труфанова В.А. Аурофузарин - новый фактор загрязнения зерна // Научн.-техн. бюлл. УНИИП.- Харьков, 1990.- N 29.-C.39-41.
8. Методика качественного определения микотоксина Т-2 в зернофураже. В книге: "Лабораторные исследования в ветеринарии: биохимические и микологические", под ред. Б.И.Антонова.- М., ВО "Агропромиздат".-1991.- С.119-122.
9. Тремасов М.Я., Титов В.В., Равилов А.З., Хисамутдинов Ф.Ф., Антонов Н.Е. Случай фузариотоксикоза у лошадей // Ветеринария.- М.-1995.- N3.- C.7.
10. Тутельян В.А., Эллер К.И., Соболев В.С. Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания Т-2 токсина в пи- щевых продуктах и продовольственном сырье. Минздрав СССР.-М., 1984.
11. Эллер К.И., Соболев В.С. Идентификация и количественное определение трихотеценовых микотоксинов методом капиллярной газожидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии.-1983.- Вып.5.-С.903-907.
12. Ikediobi C.O., Hsu I.C., Bamburg J.R., Strong F.M. Gas-liquid chromatography of mycotoxins of the trichothecene group// Anal. Biochem.- 1971.- Vol.43.-P.327-340.
13. Lee S., Cyu F.S. Radioimmunoassay of T-2 toxin in corn and wheat // J. Assoc. Off. Anal. Chem.-1981.-Vol.64.-P.156-161.
14. Pestka J.J., Lee S.L., Lau H.P., Chu F.S. Enzyme-linked immunosorbent assay for T-2 toxin // J. Am. Oil. Chem. Soc.- 1981.- Vol.58.- P. 940A-944A.
15. Peters H., Dierich M.P., Dose K. ELISA for detection of T-2 toxin // Hoppe-Seyler"s Z. Physiol. Chem.- 1982.- Vol.363.- P.1437-1441.
16. Scott P.M., Lowrence J.W., Wabbeek W. Detection of mycotoxins by TLC // Appl. Microbiol.-1970.- Vol.20.-N 5.-P.839-842.
17. Ветеринария (Москва). - 1997.- N 10.C.45-47.