Государственная опытная станция птицеводства

А.Н. Котик, В.Т. Чернобай, Н.Ф. Комисаренко, В.А. Труфанова

Украинский НИИ птицеводства

Харьковский НИ химико-фармацевтический институт

Грибы Fusarium sporotrichiella, развиваясь на кормовых и пищевых субстратах, способны вырабатывать ядовитые вещества, которые могут вызывать тяжелопротекающие заболевания сельскохозяйственных животных и человека – фузариотоксикозы [1]. Относительно структуры фузариотоксинов, обладающих дермонекротической активностью и выявляемых кожной пробой на кролике, существует две точки зрения. Согласно первой из них, микотоксины F. sporotrichiella относятся к стероидным веществам буфадиенолидной природы [2] и по строению они близки к сердечным ядам морского лука [3]. По данным других исследователей, эти вещества относятся к тетрациклическим сесквитерпенам [4].

Цель настоящей работы – выделить один из микотоксинов F. sporotrichiella и изучить его физико-химические свойства и токсическую активность.

Материалы и методы

В работе использовали четыре штамма F. sporotrichiella: 1-23 – из пробы пшеницы урожая 1972 года, завезенной из Сибири [5]; 53-1 – из пробы кукурузы, отобранной в одном из птицеводческих хозяйств Украины в момент вспышки фузариотоксикоза гусят [6]; 5328а – из коллекции лаборатории антибиотиков и микологии Всесоюзного института экспериментальной ветеринарии (выделен Е.С. Квашниной в 1954 году из нескошенного овса, вызвавшего кормовой токсикоз крупного рогатого скота в хозяйстве Московской области); 2m – мутант, полученный путем воздействия на конидии штамма 5328а N-нитрозометилмочевины и характеризующийся ограниченным ростом колоний [7]. Изучаемые штаммы выращивали на стерильной смеси овса и проса в течение 4-5 суток при +28 ^оС и затем 4 недели при +8 ^оС. Выращенные культуры штаммов на зерне высушивали и размалывали.

Методика выделения микотоксина заключалась в следующем. Культуры F. sporotrichiella экстрагировали смесью ацетона и хлороформа 1:1. Экстракты упаривали в вакууме до полного удаления растворителя, маслообразный остаток темно-бурого цвета частично очищали от примесей путем смешивания с 20-кратным объемом метанола, нагретого до 50-55 ^оС, и отделения фильтрованием выпавшего осадка.

Образцы 3б-гидрокси-4в,15-диацетокси-8б-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокси-Δ⁹-трихотецена (микотоксина Т-2) и 3б,4в-дигидрокси-15-ацетокси-8б-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокси-Δ⁹-трихотецена (микотоксина НТ-2) получены от H.R. Burmeister (Nothern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, 61604).

Результаты и их обсуждение

Установлено, что выращенные на зерне культуры штаммов 53-1 и 5328а оказывали при добавлении их в количестве < 2% в рационы 1-3-недельных цыплят и 1-3-недельных гусят сильное токсическое действие, проявляющееся в задержке роста, увеличении смертности и развитии характерных некротических поражений слизистых оболочек ротовой полости и языка. Экстракты штаммов 1-23, 53-1, 5328а и 2m вызывали дермонекротическую реакцию при нанесении на кожу кролика.

Тонкослойной хроматографией в системе этилацетат-толуол 3:1 в экстрактах штаммов 1-23, 53-1, 5328а и 2m были обнаружены три вещества с Rf 0,17, 0,30 и 0,58, флуоресцирующие в УФ-лучах голубым цветом после опрыскивания пластин серной кислотой и нагревания до 110 ^оС в течение 10 минут, а также выявляемые биоавтографически при помощи штаммов Saccharomyces fragilis 10g (получен от В.И. Дахновского, Институт микробиологии и вирусологии АН УССР) и Candida pseudotropicalis 44 (получен от В.В.Рухляды, Украинский институт экспериментальной ветеринарии). Оказалось, что вещества с R_f 0,17 и 0,58, а также по результатам биоавтографии идентичны соответственно микотоксинам НТ-2 и Т-2, используемым в качестве контроля.

С целью выделения отдельных микотоксинов экстракты штамма 2m (штамм отличается повышенной способностью к токсинообразованию) наносили на колонку силикагеля ЛС 5/40 мкм, содержащего 13% гипса. Соотношение сорбента к раздеяемому экстракту составляло 10:1. Колонку последовательно промывали петролейным эфиром; смесями петролейного эфира с бензолом в соотношениях 4:1, 1:1 и 1:4; бензолом; смесями бензола с хлороформом в соотношениях 4:1, 1:1 и 1:4; смесью хлороформа с ацетоном 1:1; ацетоном. Контроль за разделением веществ осуществляли путем тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие вещество, не отличающееся хроматографически от микотоксина Т-2, объединяли, упаривали и кристаллизовали из диэтилового эфира добавлением 10-12 % гексана.

В результате было выделено индивидуальное кристаллическое вещество с точкой плавления 150-152 ^оС;   (б) _D²¹+12 ^оС (с 1,0 в этаноле), -50 ^о  в циклогексане, -35 ^о   в смеси циклогексана с хлороформом (4:1);  С₂₄ Н_{34 О 9}.

В ИК-области спектра обнаруживаются полосы поглощения, характерные для   ОН-группы (3500, 1040, 1020 см^-1),  =СОС – группы (3040 см^-1),  сложноэфирные связи (1725, 1250 см^-1),  (СН₃)₂-СН – группы  (1170, 1145 см ^-1)  и др.

Для определения природы кислот, образующих сложноэфирные связи, были получены гидроксаматы. Методом хроматографии на бумаге [8] определены гидроксаматы уксусной и изовалериановой кислот.

Исходное вещество ацетилируется, что подтверждает присутствие в молекуле свободной оксигруппы, и не восстанавливается боргидридом натрия (отсутствие карбонильных групп).  В соединении определены два ацетильных остатка [9]. При параллельном хроматографировании полученного нами вещества и микотоксина Т-2 в системах: хлороформ-метанол (95:5), бензол-ацетон (3:2) и бензол-метанол-уксусная кислота (24:2:1) установлено, что оба вещества имеют одинаковые величины >R_f   (соответственно, 0,53,  0,58  и 0,28). Проба  смешения не дала депрессии температуры плавления; их ИК-спектры были тоже тождественны. Эти данные позволили нам заключить, что полученное нами вещество идентично 3б,4в-дигидрокси-15-ацетокси-8б-(3-метилбутирилокси)-12,13-эпокси-∆⁹-трихотецену   (микотоксину Т-2)  [4].

При изучении токсико-биологической активности выделенного нами микотоксина установлено, что микотоксин обладает значительной антибиотической активностью: в концентрации 0,25 мкг/мл он подавляет рост Saccharomyces fragilis 10g и в концентрации 0,40 мкг/мл - Candida pseudotropicalis 44 пк.. Аквариумные рыбы Lebistis reticulatus (гуппи), используемые в качестве тест-объекта для выявления в кормах микотоксинов [10], оказались весьма чувствительными к микотоксину (LD₅₀=80 мкг/л). Включение микотоксина в рационы 1-20-дневных цыплят (Gallus domesticus), индюшат (Meleagris gallopavo), утят (Anas boschas domestica) и гусят (Anser domesticus) в количестве > 1 мкг/г корма вызвало у птенцов состояние токсикоза, сопровождающееся увеличением смертности, задержкой роста, угнетением, взъерошенностью оперения, развитием характерных некротических поражений слизистых оболочек ротовой полости и языка. Нанесение микотоксина на кожу кролика в количестве 0,025 мкг вызывало гиперемию, дозы > 0,05 мкг вызывали отек и некроз.

Поскольку изучаемые штаммы F. sporotrichiella, выделенные в различных географических зонах страны (Сибирь, Украина, Московская область), способны вырабатывать микотоксины из группы 12,13-эпокси-Δ⁹-трихотеценов, то, вероятно, эти микотоксины являются этиологическим фактором фузариотоксикозов сельскохозяйственных животных, имевших место в нашей стране [11]. Полученные нами результаты соответствуют данным ряда авторов [12-15], установивших ранее, что F. sporotrichiella вырабатывают микотоксины из группы 12,13-эпокси-Δ⁹-трихотеценов.

Таким образом, в культурах штаммов F. sporotrichiella методом тонкослойной хроматографии обнаружено не менее трех веществ из группы 12,13-эпокси-Δ⁹-трихотеценов, в том числе микотоксины Т-2 и НТ-2. Адсорбционной колоночной хроматографией на силикагеле с 13% гипса из культуры F. sporotrichiella выделено кристаллическое вещество, которое по физическим и химическим свойствам идентично 3б, 4в-дигидрокси -15-ацетокси - 8б -(3-метилбутирилокси) -12,13 -эпокси-Δ9-трихотецену (микотоксину Т-2). Установлено, что выделенный микотоксин обладает значительной антибиотической активностью по отношению к Sacch. fragilis 10g и C. pseudotropicalis 44 пк. в концентрациях 0,25-0,40 мкг/мл, а также токсичен для аквариумных рыб Lebistis reticulatus (LD₅₀=80 мкг/л) и 1-20-дневного молодняка сельскохозяйственной птицы при скармливании рационов, содержащих > 1 мкг/г микотоксина. В количествах > 0,025 мкг микотоксин выявляется кожной пробой на кролике.

Литература

1. Саркисов А.Х., Квашнина Е.С. Токсико-биологические свойства грибов Fusarium sporotrichioides.- В кн.: "Перезимовавшие под снегом зерновые культуры". М.-Изд. МСХ СССР, 1948.-С.86-92.
2. Олифсон Л.Е. Химические и биологические свойства ядовитых веществ зерна, пораженного грибами Fusarium sporotrichiella: Автореф. дис. … докт. биол. наук.- Оренбург, 1965.
3. Физер Л., Физер М. Стероиды.- М., «Мир», 1964.
4. Bamburg J.R.,Strong F.M. 12,13-Epoxytrichothecenes // In: Microbial Toxins (eds. S.Kadis, A.Ciegler, S.J.Ajl).-New York. Acad. Press.1971.-Vol.7.-P.207-292.
5. Котик А.Н. Токсико-биологическое исследование кормов для птицы. – В кн.: Итоги науч. исследований и рекомендации по профилактике болезней птиц в хозяйствах промышленного типа.- М.: Изд-во ВАСХНИЛ, 1973, с. 117. 
6. Дорошко И.Н., Котик А.Н. Случай фузариотоксикоза гусят // Птицеводство.-1975.-N 11.-С.40-41. 
7. Котик А.Н. Ауксотрофные и морфологические мутанты Fusarium sporo- trichioides полученные при воздействии N-нитрозометилмочевины // Генетика.-1969.-Т.5.-N 7.-С. 98-101.
8. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса и К. Мацека.- М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1962.
9. Фридрих А. Определение ацетильной (бензольной) группы по Куну и Роту.- В кн.: Практика количественного органического микроанализа.- М.: 1939, с. 204-209.