Котик А.М., Труфанова В.О., Рухляда В.В.
Затверджені 6 березня 1998 р. Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України
1. Загальні положення.
1.1. Т-2 токсин - 8-(3-метилбутирилокси) - 4,15-диацетокси-12,13-епокситрихотец-9-ен-3-ол - є отруйний метаболіт кількох видів мікроскопичних грибів роду Fusarium, які розвиваються на зерні і продуктах його переробки. Т-2 токсин є причинний фактор аліментарних токсикозів людини і сільськогосподарських тварин.
1.2. Метод визначення Т-2 токсина грунтується на тонкошаровій хроматографії экстракту досліджуваної проби корму та подальшому біоавтографічному проявленню хроматограми за допомогою штаму мікроорганізму, високочутливого до Т-2 токсину. Чутливість методу - 50 мкг/кг корму.
2. Прилади і матеріали:
- Ацетон чда, ГОСТ 2603-71.
- Бензол чда, ГОСТ 5355-75.
- Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78.
- Натрій сірчанокислий безводний чда, ГОСТ 4166-76.
- Свинцю ацетат, ГОСТ 1027-67.
- Толуол чда, ГОСТ 5789-69.
- Етилацетат ч, ГОСТ 22300-76.
- Эфір діетиловий медичний, ГОСТ 6265-52.
- Хлороформ медичний або хч, ГОСТ 3160-5.
- Вода дистильована, ГОСТ 6709-72.
- Сусло-агар в флаконах, 50-100 мл.
- Т-2 токсин кристалічний, ТУ 10-07.77.91.
- 3. Прилади, матеріали, посуд:
- Апарат для потрушування.
- Терези аналітичні.
- Терези лабораторні технічні Т-1000 ВА-4,
- Кювети металеві емальові 30 см х 40 см для влаштування вологої камери.
- Млинок електричний лабораторний, ТУ 22-236-76.
- Мікрошприц МШ-10 на 10 мкл або калібровані скляні капіляри.
- Термостат електричний сухоповітрянний.
- Водяна електрична баня з терморегулятором.
- Лійки ділильні на 250 и 500 мл, ГОСТ 8613-75.
- Лійки хімічні діаметром 150 мм.
- Камери для ТШХ с притертими покришками.
- Колби конічні з нормальним шліфтом типу А на 500 мл.
- Мікропіпетки на 0,2 мл.
- Піпетки на 2 і 10 мл.
- Пластинки для ТШХ "Сілуфол" 15 см х 15 см.
- Фільтри паперові.
- Циліндри мірні на 100, 250 і 500 мл.
4. Зберігання, культивування і підготовка до роботи тест-мікроорганізму.
4.1. Тест-мікрорганізмом служить Саndida pseudotropicalis штам 44 пк, який надсилає Інститут птахівництва УААН (313410, Харківська область, Зміївський район, с. Борки).
4.2. Зберігають культури Candida pseudotropicalis штам 44 пк в холодильнику при 4-6 0С. Периодичність пересіву - 1 раз в 6 міс.
4.3. Candida pseudotropicalis штам 44 пк культивують на скошеному сусло-агарі в термостаті при 370С на протязі 24 годин. Добову культуру змивають стерильною дистильованою водою (4-5 мл) до одержання концентрації 5 од. по оптичному стандарту мутності.
5. Хід роботи.
5.1. Екстракція. Із средньої проби розмеленого зерна або комбікорму беруть пробу масою 25 г, вносять в конічну колбу на 500 мл, добавляють 20 мл 10%-ного розчину NaCl і старанно перемішують. Потім добавляють 120 мл ацетону і суміш потрушують на протязі 1 год., після чого фільтрують через паперовий фільтр в мірний циліндр і відбирають 100 мл фільтрату.
5.2. Очистка екстракту. До 100 мл фільтрату добавляють 20 мл 15%-ного розчину ацетату свинцю і 30 мл води, перемішують і витримують на протязі 10 хв. Осадок, що утворився, відділяють шляхом фільтрування через паперовий фільтр. 120 мл фільтрату вносять в ділильну лійку, добавляють 40 мл гексану, струшують і після розподілу фаз відділяють нижній водно-ацетоновий шар (гексановий шар вилучають). До водно-ацетонового шару добавляють два раза по 20 мл гексану, кожен раз струшують і після розподілу фаз вилучають верхній гексановий шар. Потім до водно-ацетонового экстракту в ділильну лійку два рази добавляють по 40 мл хлороформу; кожного разу струшують і для подальшого аналізу після розподілу фаз відбирають нижній хлороформовий шар. Хлороформові екстракти об'єднують, добавляють 5-7 г безводного сірчано кислого натрію, струшують і залишають на 10 хв. Розчин фільтрують, фільтрат упаюють досуха. Сухий залишок розчиняють в 1-2 мл бензолу і переносять в пробірку на 5 мл, упарюють досуха, залишок розчиняють в 100 мкл бензолу.
5.3. Розподілення екстракту в тонкому шарі сорбенту. Екстракт в кількостях 2, 5 і 10 мкл наносять за допомогою мікрошприца на стартову лінію пластинки "Сілуфол" на відстані 1,5 см від нижнього краю і 2 см від країв та один від одного. За речовину-свідка наносять 2 мкл розчину Т-2 токсину в бензолі (100 мкг/мл). Пластинку хроматографують в системі діетиловий ефір-гексан 1:1, висушують, потім повторно хроматографують в системі етилацетат-толуол 3:1 і висушують.
5.4. Біоавтографічне виявлення Т-2 токсину. На поверхню горизонтально розміщеної хроматографічної пластинки наносять 12 мл розплавленого сусло-агару і витримують при кімнатній температурі 10-20 хв., після чого на поверхню агара наносять і рівномірно розподіляють 2-3 мл суспензії тест-мікроорганізму (див. п. 4.3.). Пластинку поміщають у вологу камеру горизонтально і витримують в термостаті при 28-30 0С на протязі 14-16 годин.
6. Облік показників.
6.1. Виявлення Т-2 токсину і визначення його кількості проводять за наявності зони відсутності росту тест-мікроорганізму з урахуванням її діаметру (мм).
6.2. Зона відсутності росту, ідентична по хроматографичній рухливості зоні, яка викликана речовиною-свідком, вказує на наявність в пробі Т-2 токсину.
6.3. Кількість Т-2 токсину в пробі визначають за формулою:
Набор статьи продолжается
Перепечатка материалов без ссылки на наш сайт запрещена!