Методичні вказівки по якісному і кількісному визначенню т-2 токсину в зерні і комбікормах

Обновлено 16.03.2013 17:55 | Просмотров: 1999

Котик А.М., Труфанова В.О., Рухляда В.В.

Затверджені 6 березня 1998 р. Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства АПК України

1. Загальні положення.

1.1. Т-2 токсин - 8-(3-метилбутирилокси) - 4,15-диацетокси-12,13-епокситрихотец-9-ен-3-ол - є отруйний метаболіт кількох видів мікроскопичних грибів роду Fusarium, які розвиваються на зерні і продуктах його переробки. Т-2 токсин є причинний фактор аліментарних токсикозів людини і сільськогосподарських тварин.

1.2. Метод визначення Т-2 токсина грунтується на тонкошаровій хроматографії экстракту досліджуваної проби корму та подальшому біоавтографічному проявленню хроматограми за допомогою штаму мікроорганізму, високочутливого до Т-2 токсину. Чутливість методу - 50 мкг/кг корму.

2. Прилади і матеріали:

Ацетон чда, ГОСТ 2603-71.
Бензол чда, ГОСТ 5355-75.
Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78.
Натрій сірчанокислий безводний чда, ГОСТ 4166-76.
Свинцю ацетат, ГОСТ 1027-67.
Толуол чда, ГОСТ 5789-69.
Етилацетат ч, ГОСТ 22300-76.
Эфір діетиловий медичний, ГОСТ 6265-52.
Хлороформ медичний або хч, ГОСТ 3160-5.
Вода дистильована, ГОСТ 6709-72.
Сусло-агар в флаконах, 50-100 мл.
Т-2 токсин кристалічний, ТУ 10-07.77.91.
3. Прилади, матеріали, посуд:
Апарат для потрушування.
Терези аналітичні.
Терези лабораторні технічні Т-1000 ВА-4,
Кювети металеві емальові 30 см х 40 см для влаштування вологої камери.
Млинок електричний лабораторний, ТУ 22-236-76.
Мікрошприц МШ-10 на 10 мкл або калібровані скляні капіляри.
Термостат електричний сухоповітрянний.
Водяна електрична баня з терморегулятором.
Лійки ділильні на 250 и 500 мл, ГОСТ 8613-75.
Лійки хімічні діаметром 150 мм.
Камери для ТШХ с притертими покришками.
Колби конічні з нормальним шліфтом типу А на 500 мл.
Мікропіпетки на 0,2 мл.
Піпетки на 2 і 10 мл.
Пластинки для ТШХ "Сілуфол" 15 см х 15 см.
Фільтри паперові.
Циліндри мірні на 100, 250 і 500 мл.

4. Зберігання, культивування і підготовка до роботи тест-мікроорганізму.

4.1. Тест-мікрорганізмом служить Саndida pseudotropicalis штам 44 пк, який надсилає Інститут птахівництва УААН (313410, Харківська область, Зміївський район, с. Борки).

4.2. Зберігають культури Candida pseudotropicalis штам 44 пк в холодильнику при 4-6 0С. Периодичність пересіву - 1 раз в 6 міс.

4.3. Candida pseudotropicalis штам 44 пк культивують на скошеному сусло-агарі в термостаті при 370С на протязі 24 годин. Добову культуру змивають стерильною дистильованою водою (4-5 мл) до одержання концентрації 5 од. по оптичному стандарту мутності.

5. Хід роботи.

5.1. Екстракція. Із средньої проби розмеленого зерна або комбікорму беруть пробу масою 25 г, вносять в конічну колбу на 500 мл, добавляють 20 мл 10%-ного розчину NaCl і старанно перемішують. Потім добавляють 120 мл ацетону і суміш потрушують на протязі 1 год., після чого фільтрують через паперовий фільтр в мірний циліндр і відбирають 100 мл фільтрату.

5.2. Очистка екстракту. До 100 мл фільтрату добавляють 20 мл 15%-ного розчину ацетату свинцю і 30 мл води, перемішують і витримують на протязі 10 хв. Осадок, що утворився, відділяють шляхом фільтрування через паперовий фільтр. 120 мл фільтрату вносять в ділильну лійку, добавляють 40 мл гексану, струшують і після розподілу фаз відділяють нижній водно-ацетоновий шар (гексановий шар вилучають). До водно-ацетонового шару добавляють два раза по 20 мл гексану, кожен раз струшують і після розподілу фаз вилучають верхній гексановий шар. Потім до водно-ацетонового экстракту в ділильну лійку два рази добавляють по 40 мл хлороформу; кожного разу струшують і для подальшого аналізу після розподілу фаз відбирають нижній хлороформовий шар. Хлороформові екстракти об'єднують, добавляють 5-7 г безводного сірчано кислого натрію, струшують і залишають на 10 хв. Розчин фільтрують, фільтрат упаюють досуха. Сухий залишок розчиняють в 1-2 мл бензолу і переносять в пробірку на 5 мл, упарюють досуха, залишок розчиняють в 100 мкл бензолу.

5.3. Розподілення екстракту в тонкому шарі сорбенту. Екстракт в кількостях 2, 5 і 10 мкл наносять за допомогою мікрошприца на стартову лінію пластинки "Сілуфол" на відстані 1,5 см від нижнього краю і 2 см від країв та один від одного. За речовину-свідка наносять 2 мкл розчину Т-2 токсину в бензолі (100 мкг/мл). Пластинку хроматографують в системі діетиловий ефір-гексан 1:1, висушують, потім повторно хроматографують в системі етилацетат-толуол 3:1 і висушують.

5.4. Біоавтографічне виявлення Т-2 токсину. На поверхню горизонтально розміщеної хроматографічної пластинки наносять 12 мл розплавленого сусло-агару і витримують при кімнатній температурі 10-20 хв., після чого на поверхню агара наносять і рівномірно розподіляють 2-3 мл суспензії тест-мікроорганізму (див. п. 4.3.). Пластинку поміщають у вологу камеру горизонтально і витримують в термостаті при 28-30 ⁰С на протязі 14-16 годин.

6. Облік показників.

6.1. Виявлення Т-2 токсину і визначення його кількості проводять за наявності зони відсутності росту тест-мікроорганізму з урахуванням її діаметру (мм).

6.2. Зона відсутності росту, ідентична по хроматографичній рухливості зоні, яка викликана речовиною-свідком, вказує на наявність в пробі Т-2 токсину.

6.3. Кількість Т-2 токсину в пробі визначають за формулою:

Набор статьи продолжается